Transwell实验技术

微孔滤膜培养小室及双室联合培养系统（Transwell 实验）：应用微孔滤膜培养小室，进行胶质瘤细胞与内皮细胞的联合培养，可以更接近体内环境，模拟瘤细胞对血管内皮细胞的作用，滤膜上8μm的微孔可允许内皮细胞穿过到达膜的下面，这些穿越迁移的内皮细胞可粘附于膜的下面，通过计数滤膜下面的细胞可基本反映细胞的迁移情况。Transwell的基本原理是将Transwell小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称为下室，上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液，上下层培养液以膜相隔。将细胞种在上室内，由于膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影。选择不同材料的膜和孔径，可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

（一）实验材料及试剂

24孔培养板、Transwell小室、倒置显微镜、酒精灯、移液枪、CO₂培养箱、细胞计数板等；血清、低血清DMEM培养液、多聚甲醛、结晶紫、PBS等。

（二）实验内容

1、分别取实验分组的细胞种板前1天，血清饥饿12小时，常规消化、离心收集细胞，用低血清DMEM培养液（含0.2% FBS）混悬成密度为5×10⁵/ml的单细胞悬液。

2、将Transwell小室放入24孔培养板中，上室内加入100 μl细胞悬液（约5×10⁴细胞），下室内加入500 μl含10% FBS的DMEM培养液。

3、置于5% CO₂，37℃孵箱培养24小时后，PBS洗2次，用棉球小心擦去上室内细胞，4%多聚甲醛固定20~30 min，PBS洗2次，0.1 %结晶紫染色30 min，PBS洗2次，去掉多余染料，显微镜下观察拍照。

（三）注意事项

Transwell小室可重复利用多次，但在棉签擦拭的时候力度避免过大，以免损伤小室膜；重复使用之前可观察小室膜是否出现裂痕，若出现较多裂痕可停止使用。